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複数回膜貫通型標的タンパク質の開発プラットホーム

Transmembrane Proteins Platform
バックグラウンド
Multi-pass transmembrane target proteins
                    図1. 複数回膜貫通型標的タンパク質
膜貫通型タンパク質は細胞膜のリン脂質二重層に嵌められている膜を通過するタンパク質のことです。膜貫通領域の相互作用によって膜外と膜内の環境が繋がれ、シグナル伝達のための活性化と応答反応を達成し、細胞内外の構造と機能的な変化を調節できます。多くの疾患は異常な膜貫通型タンパク質の機能とは関連性が見られるので、様々の機能を持っている膜貫通型タンパク質は医薬品の理想的な標的になっています。
全長構造の複数回膜貫通型標的タンパク質は重要性を示しています。例えばCD20の場合はRitux*mabはCD20に対し、認識部位が一次エピトープECL2のほか、二次エピトープECL1/ECL2も含まれています。Ritux*mabのCDC効果も二次エピトープECL1/ECL2に影響されることが証明されました[1]。が、複数回膜貫通型タンパク質は構造が複雑なうえに、複数の疎水性膜貫通領域があり、宿主細胞における発現レベルは非常に低いです。
全長構造の複数回膜貫通型標的タンパク質の製造上の問題点の解決に向け、複数回膜貫通型タンパク質を標的とする医薬品の研究を促進できるよう、弊社は複数回膜貫通型タンパク質の製造のためより包括的なソリューションを提供しております。様々なニーズに応えるために、CD20, Claudin18.2, CD133, GPRC5D, CXCR4, CCR5 and CCR8など種類が豊富な全長構造複数回膜貫通型タンパク質を用意できます。(図1)
三種類のテクノロジープラットホーム
VLPテクノロジープラットホーム
 VLP Platform
技術の原理

弊社はHEK293の発現システムに基づき、VLPテクノロジープラットホームを作っています。このプラットホームを用いて、完全なコンフォメーションを持っている膜タンパク質を細胞の表面に集合させ、抗体免疫とスクリーニングに利用できるよう、複雑な構造の膜タンパク質を可溶で高濃度のタンパク質に変えます。作られたエンベロープVLPsは細胞膜上に正しく折りたたまれた複数回膜貫通型タンパク質を提示し、それによって標的になる天然コンフォメーションを識別する抗体を誘導し、スクリーニングできます。 VLPテクノロジープラットフォームによって製造される通常の複数回膜貫通型タンパク質以外にも、弊社はカスタマイズサービスも承っております。

ユニークな技術
全長膜貫通型タンパク質で、ECDエピトープが完全である
VLPの中の標的抗原は過剰発現細胞と比べて発現量が高い
免疫原性の改善
100-300 nmの大きさで、体内樹状細胞とファージディスプレイの最高のターゲットになる
免疫抗原/ELISA/SPR/BLI /細胞実験/CAR陽性率測定などに利用できる
膜タンパク質-可溶化剤テクノロジープラットフォーム
Detergent Micelle Platform
技術の原理

複数回膜貫通型タンパク質の膜貫通領域は疎水性が高く、通常のバッファーの中で正しいコンフォメーションを維持することは困難です。可溶化剤を使うことでそれを解決できます。弊社は昆虫細胞と哺乳類細胞の発現技術をもとにして、開発が困難な医薬品に使う標的膜貫通型タンパク質の発現、精製プラットホームを構築し、よく使われている可溶化剤の中からDDM / CHS(製品番号DC-11)などの効果の良いタイプを選別しました。それによって複数回膜貫通型標的タンパク質の可溶性を大幅に向上させ、天然のコンフォメーションの形成を促進しました。

ユニークな技術
複数の膜貫通タンパク質は完全なコンフォメーションを持っています。
正確な定量化を実現できる。
免疫抗原/ELISA/SPR/BLIに利用できる
Nanodiscテクノロジープラットフォーム
Nanodisc Platform
技術の原理

ナノディスク(Nanodisc)は膜足場タンパク質(MSP)とリン脂質分子で構成されたリン脂質二重膜構造です。膜タンパク質をナノディスクの特殊な構造に挿入できます。生物活性が保て、可溶性も良好なので、よく利用されています。弊社の研究開発チームが様々な努力をし、工業化のスケールアップ生産に適しているNanodiscのアセンブリプロセスに成功し、膜貫通型タンパク質Nanodisc製品を長期的かつ安定的に提供できます。

ユニークな技術
全長構造膜貫通型タンパク質は天然の細胞膜のような環境の中で、生物活性が保たれる。
可溶性がよく、可溶化剤は不要。
免疫抗原/ELISA/SPR/BLI/細胞培養実験/CAR陽性検査に利用できる。
製品リスト
  • VLP

  • 膜タンパク質-可溶化剤

  • Nanodisc

分子製品番号製品説明用途注文/予約注文
分子製品番号製品説明用途注文/予約注文
分子製品番号製品説明用途注文/予約注文
製品実例

ご参考にELISA&SPRによるデータや実験方法を無償で提供しております。必要な方はクリックしてプロトコルをお申し込みください。

Claudin18.2-VLP

SEMによって検証済みアセンブリ
全長Claudin18.2-VLP(CL2-H52P7)を電子顕微鏡で観察し,構造が正確であることを確認。
Claudin18.2-VLP
ELISAによって検証済み良好な生物活性
ELISA

Immobilized Human Claudin-18.2 Full Length Protein-VLP (Cat. No. CL2-H52P7) at 5 μg/mL (100 μL/well) can bind Monoclonal Anti-Chimeric Claudin-18.2 Antibody, Human IgG1 with a linear range of 0.2-3 ng/mL (QC tested).

SPRによって検証済み高親和性
SPR

Human Claudin-18.2 Full Length Protein-VLP (Cat. No. CL2-H52P7) captured on CM5 Chip via Anti-Claudin-18.2 antibody can bind Anti-Claudin-18.2 antibody with an affinity constant of 0.374 nM as determined in a SPR assay (Biacore T200) (Routinely tested).

CAR陽性実験に適しています。
FACS検証によって、Claudin18.2-CAR-293細胞にHuman Claudin18.2-VLPタンパク質(カタログ番号CL2-HF218))と陰性対照タンパク質(カタログ番号VLP-NF2P4)をそれぞれトランスフェクトした。 Claudin18.2-VLPタンパク質(カタログ番号CL2-HF218))がClaudin18.2-CAR-293細胞に特異的に結合できることを示しました。
Good bioactivity validation of CD20-DDM/CHS

2e5 of Anti-Claudin-18.2 CAR-293 cells were stained with 100 μL of 3 μg/mL of Fluorescent Human Claudin-18.2 Full Length Protein-VLP (Cat. No.CL2-HF218) and negative control protein respectively, FITC signals was used to evaluate the binding activity (Routinely tested).

CD20- DDM/CHS

実験データ1
ELISAの検証によって、全長のCD20-DDM/CHS(CD0-H52H3)はリツキシマブ(Ritux*mab)と特異的に結合し、定量域は0.4-3 ng/mLであることが確認された。
Good bioactivity validation of full-length CD20-DDM/CHS

Immobilized Ritux*mab at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Human CD20 Full Length, His Tag, HEK293 (SPR verified) (Cat. No. CD0-H52H3) with a linear range of 0.4-3 ng/mL (in presence of DDM and CHS).

実験データ2
ELISAの検証によって、ビオチン標識全長構造CD20-DDM/CHS(CD0-H82E5)はリツキシマブ(Ritux*mab)と特異的に結合し、定量域は4-63 ng/mLであることが確認された。
Good bioactivity validation of CD20-DDM/CHS

Immobilized Ritux*mab at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Biotinylated Human CD20 Full Length, His,Avitag (HEK293) (Cat. No. CD0-H82E5) with a linear range of 4-63 ng/mL (in presence of DDM and CHS).
                 

実験データ3
表面プラズモン共鳴(SPR)法を用いて、ビオチン標識全長構造CD20-DDM/CHS(CD0-H82E5)はリツキシマブ(Ritux*mab)と特異的に結合し、結合係数は1.73  nMであることが確認された。
High affinity validation of CD20-DDM/CHSE

Biotinylated Human CD20, His,Avitag (HEK293) (Cat. No. CD0-H82E5) captured on Biotin CAP-Series S Sensor Chip can bind Ritux*mab with an affinity constant of 1.73 nM as determined in a SPR assay (in presence of DDM and CHS) (Biacore T200).

CD133-Nanodisc

実験データ1
ポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAGE)によって、hisタグの全長構造のCD133-Nanodiscはタンパク質の純度が90%以上であることが確認された。
               
Purity greater than 90% by SDS-PAGE

Human CD133 Full Length, His Tag (Nanodisc) ((Cat. No. CD3-H52H1))on SDS-PAGE under reducing (R) condition. The gel was stained overnight with Coomassie Blue. The purity of the protein is greater than 90%.
                  

Good bioactivity validated by ELISA
ELISAの検証によって、全長構造CD133-Nanodisc(CD3-H52H1)は抗ヒトCD133(133-3)モノクローナル抗体と特異的に結合でき、定量域が0.2-4 ng/mLであることが確認された。
ELISA

Immobilized Human CD133 Full Length, His Tag (Nanodisc) (Cat. No. CD3-H52H1) at 1 μg/mL (100 μL/well) can bind Monoclonal Anti-Human CD133 (133-3) Antibody, Human IgG1 with a linear range of 0.2-4 ng/mL (QC tested).

Questions & Answers
Transmembrane Proteins Platform
Q1:For immunization and antibody screening, which platform should I choose for Claudin18.2?

Our Claudin18.2 has been developed with VLP and DMM/CHS platforms. Both of these versions are suitable for immunization and screening. However, the VLP version may be preferred for improved immunogenicity. For accurate affinity measurements, we recommend using the DDM/CHS version (the detergent version).

Q2:Why do you want to emphasize the importance of full-length protein? After all, antibodies and antigens only bind on the extracellular domain.

Multi-pass transmembrane proteins span the cell membrane multiple times forming multiple extracellular domains. For example, Claudin18.2, CD20, and CD133 have two extracellular loops (ECLs) with each ECL having specific functions and interactions with each other. Full length can ensure that the protein conformation is biologically relevant while enabling the ECL to be completely exposed for improved screening of ideal antibodies. As the figure below illustrates, the full length is active and relevant compared to isolated extracellular domain. It is not the case that ACRO always emphasizes full length proteins, but drug discovery R&D work needs the full-length multi-pass transmembrane proteins. Indeed, when compared, the activity of only the ECL region is worse than that of the full-length protein. ACRO is committed to providing the high quality and relevant products that meet customers' needs.

Structure of Full-length CD20 Protein
Q3:How do you exclude non-specific antibodies for the full-length membrane proteins in VLP and Nanodisc platforms?

The influence of non-specific antibodies cannot be ignored. Using membrane proteins under the VLP and Nanodisc platforms may produce non-specific antibodies. Both of our platforms have corresponding isotype controls for reverse-screening and excluding non-specific antibodies. Membrane protein-VLP has an isotype control product (Cat. No. VLP-NF2P4). Membrane protein-Nanodisc has two isotype control products, one of which is MSP1D1(Cat. No. APO-H51H3) as the isotype control for tag free version. If a biotinylated membrane protein-Nanodisc is used, MSP1D1(Cat. No. APO-H81Q5) can be used as the isotype control.

VLP/Nanodisc isotype control products
Q4:Compared to other platforms, what are the advantages of Nanodiscs?

Nanodisc-membrane proteins are quite different from detergent stabilized membrane proteins. First of all, in principle, Nanodisc-membrane protein are assembled on native membrane-like structures and are completely detergent free. This opens up applications like immunization use for Nanodisc assembled proteins otherwise restricted due to detergent dissolving native cell membrane and causing damage to cells. In addition, the Nanodisc version of membrane proteins are compatible with cell-based assays and CAR expression detections. The Nanodisc platform used by ACRO has been authorized by the patent holder and can be used with confidence during the development process.

Q5:How do you confirm that Claudin18.2-VLP contains the target protein and how do you evaluate its purity? In the EM image on your product page, how do you tell whether the protein is embedded on the VLP particle?

Claudin18.2-VLP is tested and verified by anti-Claudin18.2 specific antibodies. The purity is evaluated by SDS-PAGE/HPLC/DLS/SEM. The conventional negative dye EM cannot see whether Claudin18.2 is on the VLP due to its low resolution. Binding activity with anti-Claudin18.2 specific antibodies can confirm the presence of Claudin18.2 on the particles.

Q6:Would VLP-membrane proteins be suitable for lyophilization? Could it be emulsified, and are there any requirements for the type of adjuvant? What are the precautions for using VLP formulated proteins for immunization?

We currently store all VLP formulated products as liquids at -70°C and ship on dry ice. We do store non- enveloped VLP products by freeze-drying. VLP immunization mainly requires attention to the choice of adjuvant dose, because VLP itself can enhance immunogenicity, which is not the case for conventional protein products.

Q7:You also have VLP versions of CD24 and PD-1. Are they the same as Claudin18.2? What is the difference between enveloped VLP and non-enveloped VLP?

CD24 and PD-1 are soluble proteins. They are not multi-pass transmembrane proteins, so non-enveloped VLPs are used. While multi-transmembrane proteins have hydrophobic transmembrane regions and need to be embedded on the membrane of the enveloped VLPs. The difference between VLP and enveloped VLP is whether there is a phospholipid bilayer membrane on the surface of the VLP.

Q8:How long is the lead time for customized full-length membrane protein?

If customized, the membrane protein in VLP format is expected to take 6-8 weeks.  The DDM/CHS version requires expression and purification conditions optimization of the target multi-pass transmembrane protein and detergent screening, so the development cycle is longer lasting more than 8 weeks. The customized Nanodisc version of membrane protein requires an additional 4 weeks on top of the DDM/CHS development time.

参考資料

Structure of CD20 in complex with the therapeutic monoclonal antibody Ritux*mab.

The role of CD133 in cancer: a concise review.

  • Authors: Paige M. Glumac , Aaron M. LeBeau.

  • Journal: Glumac and LeBeau Clin Trans Med

  • Download Full Article

Structural and Molecular Interactions of CCR5 Inhibitors with CCR5.

  • Authors: Kenji Maeda, Debananda Das et al.

  • Journal: Journal of Biological Chemistry

  • Download Full Article

Role of Conserved Disulfide Bridges and Aromatic Residues in Extracellular Loop 2 of Chemokine Receptor CCR8 for Chemokine and Small Molecule Binding.

  • Authors: Line Barington, Pia C. Rummel, et al.

  • Journal: Journal of Biological Chemistry

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